ELISA屬固相，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的時(shí)機(jī)，只有靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才干到達(dá)反響的終點(diǎn)。在其后參加的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反響總是需求必定時(shí)刻的溫育。

　　ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不可濺起，不可發(fā)作氣泡。

　　加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。

　　每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震動(dòng)器上震動(dòng)1分鐘以保證混和。

　　加酶結(jié)合物使用液和底物使用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程敏捷完成。在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反響的完成需求有必定的溫度和時(shí)刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。

　　溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。在建立ELISA辦法作反響動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，試驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，ELISA試劑盒產(chǎn)品的生成可達(dá)高峰。為加速反響，可進(jìn)步反響的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為完全，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中，以形成多的沉積。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予選用。