結合態淀粉合成酶（GBSS）活性檢測試劑盒說明書

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。貨號：4163

規格：25T/24S、50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前每支加入 5 mL 試劑一。

2、 試劑五：臨用前每支加入 8 mL 試劑一。

3、 試劑六：臨用前取 1 支加入 208 μL 雙蒸水，充分溶解備用，用不完的試劑 4℃保存。

4、 試劑八：每支臨用前加入溶解好的 4 mL 試劑四。

5、 反應液Ⅰ的配制：臨用前在試劑二中加入 7 mL 試劑一，緩慢加熱，逐漸升溫使其溶解，冷卻后加入試劑三混合溶解，這樣可以分兩批配制并且測定。

產品說明： 產品說明：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應，主要負責直鏈淀粉的合成。

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時生成ADP；進一步通過反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應生成的ADP數量呈正比，通過340nm下測定NADPH的增加量，可以計算GBSS活性。

注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者

增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

稱取約 0.1g 組織加入 1mL 提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 在EP管中按順序加入下列試劑

混勻后立即在 340nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。三、GBSS 活性計算

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本質量計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。GBSS活性（U/g 質量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W

V測：測量體積，0.78mL；V反總：反應體積，0.62mL；V提取：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，20min；ε： NADPH消光系數，6.22×10-3mL/(nmol_˙cm)；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。