α-淀粉酶（α-AL）活性檢測試劑盒說明書  微量法

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。若有黃色晶體析出，可適當(dāng)加熱溶解后再用。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，10mg 無水葡萄糖，臨用前加 1mL 蒸餾水，配成 10mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原 3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)，在 540 nm 有吸收峰；通過測定 540 nm 吸光度增加速率，計算淀粉酶活性。α-AL 耐熱，但是β-淀粉酶可在 70℃ 鈍化 15min。因此粗酶液經(jīng)過 70℃鈍化 15min，就只有α-AL 能夠催化淀粉水解。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀或可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量比色皿、研缽和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

稱取約 0.1g 樣本，加 0.8 mL 蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取 15min，每隔 5min 振蕩 1 次，使其充分提取；6000g，室溫離心 10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至 10 mL，搖勻，即為淀粉酶原液。

二、測定步驟和加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078 和

0.0039mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、按操作表依次加入各試劑：

混勻，90℃ 水浴 10min，取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 處讀取對照管、測定管、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管的吸光度，分別記為 A 對照、A 測定、A 標(biāo)準(zhǔn)和 A 空白，計算ΔA 測定=A 測定-A 對照，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白。

三、α-淀粉酶活性計算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 x 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程 y=kx+b。將ΔA 測定帶入方程得到 x（mg/mL）。

2、α- 淀粉酶活性的計算

a. 按照樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1 個酶活力單位。

α- 淀粉酶活性(mg/min/g 鮮重)=x×V 樣÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=2×x÷W

b. 按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1 個酶活性單位。

α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×V 樣÷（V 樣×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 mL；V 樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；T：反應(yīng)時間，5min。

注意事項：

當(dāng)測定的吸光值大于 1.5 時，可以對樣本進行適當(dāng)稀釋后測定。